浅析大鼠CRH基因干扰慢病毒载体的构建论文
促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)由下丘脑室旁核(PVN)合成，促进腺垂体合成与释放促肾上腺皮质激素(ACTH)。CRH 作为应激反应的中枢起始调节因子之一，在应激时含量明显增高。Plotsky等观察到大鼠新生期母婴分离引起的应激模型中PVN内CRH mRNA及CRH 受体1(CRH-R1)表达明显增多。RNA干扰(RNAi)是一种通过降解靶基因mRNA使靶基因表达减少或沉默的技术，再结合慢病毒载体技术就实现了长期、稳定的基因沉默效应。本实验旨在筛选CRH 基因的RNAi有效靶点，构建和鉴定CRH 基因RNAi的慢病毒载体，为后期研究CRH 神经元敏感化在应激反应中的作用及机制奠定基础。
材料与方法
一、材料
包装细胞293T细胞株(吉凯基因公司);大肠杆菌菌株DH5α、DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司);pEGFP-N1-3FLAG Vector(BD 公司);EcoRⅠ/BamHⅠ内切酶(上海吉凯基因化学技术有限公司);限制性内切酶、T4DNA连接酶(NEB公司);质粒DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA 纯化试剂盒(Qiagen公司);Mouse Anti-flag(1∶3000)(Sigma公司)。
二、方法
1.CRH 基因过表达质粒构建
载体GV143质粒XhoⅠ/KpnⅠ酶切后，化学合成目的基因。用XhoⅠ/KpnⅠ酶切化学合成的含有目的基因的质粒，酶切产物电泳回收后进行定向连接，其产物转化DH5α大肠杆菌。选择单克隆进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序(上海吉凯基因化学技术有限公司)，比对正确的克隆即为构建成功的过表达质粒。用于菌落PCR鉴定转化子的引物为：(1)CMV-F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′;(2)EGFP-N-R：5′-CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG-3′。
2.RNAi病毒载体质粒构建
针对CRH mRNA(NM_031019)，设计并合成4对针对CRH基因的小干扰RNA(siRNA)的核苷酸序列，同时设计并合成一段无意义序列作为阴性对照。挑取阳性克隆送至上海吉凯基因化学技术有限公司测序鉴定，构建的4种干扰质粒分别命名为KD1、KD2、KD3和KD4。该RNAi病毒载体可同时表达绿色荧光蛋白(GFP)，用于判断转染效率。根据Invitrogen公司的Lipofectamine 2000使用说明共转染培养好的工具细胞293T细胞。
3.CRH基因RNAi有效靶序列筛选
分为三组：NC组共转染过表达质粒和阴性对照病毒载体质粒作为阴性对照;CON 组为不转染任何质粒的293T细胞;KD组共转染过表达质粒和RNAi靶点病毒载体质粒(分为KD1、KD2、KD3、KD4，分别含有针对目的基因的不同干扰靶点序列的RNAi病毒载体质粒)。转染后24h荧光显微镜下观察转染效果，转染后36h收集细胞抽提蛋白，使用抗GFP抗体Western blot法检测目的基因的表达情况，进而判断不同靶点的干扰效果。
4.病毒包装
293T 细胞培养至活细胞达70%-80%时转染筛选出的干扰质粒和DNA溶液。把稀释后的干扰质粒和DNA混合液与稀释后的Lipofectamine 2000于5min内混合，室温温育20min，于37℃细胞培养箱中培养。8h后倒去含有转染混合物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，弃洗液。每瓶细胞中加入含10%胎牛血清的细胞培养基25ml，培养箱内继续培养48h。收集转染48h的293T细胞上清液，于4℃、4000 g离心10min，收集上清液;将上清液以0.45μm滤器过滤后置于40ml超速离心管中，4℃、4000 g 离心10-15min，将病毒浓缩液移出。
5.病毒生物学滴度测定
测定前1d在96孔板铺板，每孔加4×104 个293T细胞，体积为100腳莀__M_μl。用系列稀释的制备的病毒载体分别加入96孔培养板。24h后加入完全培养基100μl。4d后荧光显微镜观察荧光表达情况。根据荧光图片中GFP表达情况，计数最大稀释倍数孔中的带有荧光的细胞个数，计算病毒滴度(TU/ml)=(荧光细胞个数×转染时细胞数/100×每孔加入病毒稀释液体积)×1/稀释浓度。
结果
一、CRH 基因过表达质粒构建
CRH 基因过表达质粒构建GV143载体进行XhoⅠ/KpnⅠ酶切。化学合成目的.基因，用XhoⅠ/KpnⅠ酶切化学合成的含有目的基因的质粒得到565bp的片段，将其连入酶切载体中。挑单克隆PCR得到845bp的特异性条带。送200μl进行测序，测序结果与目标序列完全一致，表明CRH基因过表达质粒构建成功。将CRH 基因过表达质粒转染293T细胞，收集细胞总蛋白。通过Western blot检测转染293T的样品，可以观察到49kD附近处有特征条带，其大小和目的基因融合蛋白相比大小相符(见内页4图4)。转染24h后，荧光显微镜下观察转染效果。
二、CRH 基因RNAi有效靶序列筛选
重组克隆载体PCR鉴定、测序，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，连接入短发夹RNA(shRNA)的片段的阳性克隆PCR的片段大小为340bp;没有连接入shRNA的片段的空载体克隆PCR片段大小为299bp。经测序分析后确认插入序列正确，说明GV143-CRH中已含有siRNA 模板DNA的片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳。转染24h后，荧光显微镜下观察转染效果。从Western blot结果可以看出，KD2、KD3、KD4靶点对CRH 基因的表达有敲减作用，是有效靶点。我们选择KD2靶点(siRNA 序列5′-TCAGGAAACTGATGGAGATTATCTCGAGATAATCTCCATCAGTTTCCTGTTTTTTC-3′)进行CRH 基因RNAi慢病毒表达载体的构建。
三、病毒包装及生物学滴度测定
干扰质粒和辅助质粒共转染293T细胞后在荧光显微镜下发出绿色荧光。病毒原液滴度为1.5×109 TU/ml，表明我们已成功构建了高滴度的慢病毒载体，病毒成功包装。
讨论
1981年Vale从绵羊下丘脑中分离出调节ACTH释放的肽，即CRH。CRH 不但在脑组织中分布广泛，也可广泛分布于中枢及外周神经组织，中枢内以下丘脑含量最高，主要分布于PVN的小细胞中，在其他神经核团中也分布有少量CRH。CRH 调节下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)，参与应激反应。CRH是通过CRH-R起作用的，CRH-R在脑的不同部位均有表达，目前已知的CRH-R有CRH-R1、CRH-R2和CRH-R3三种亚型。Hsu等报道急性应激可引起大鼠丘脑CRH mRNA水平增高，而重复应激不改变CRH mRNA水平，阻断急性应激所诱导的CRH mRNA水平增高的效应。慢性应激时，CRH神经元胞体增大，接受谷氨酸能及去甲肾上腺素能传入神经纤维增多，CRH 释放增加。
RNAi技术是一种通过触发同源RNA 降解使目的基因沉默的技术，由于具有特异性、高效性、多能性而被广泛应用。RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时嵌入慢病毒载体技术，使目的基因整合到宿主的DNA序列，慢病毒介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定。与其他病毒载体相比，扩大了载体感染细胞的范围，适用于体内基因治疗，为研究基因功能提供了更强有力的工具。本实验在确定CRH 基因存在于PVN的前提下，用Oligoengine软件，设计出GC含量在45%-55%的4个shRNA 序列及一个阴性对照序列，连接慢病毒载体GV118，测序鉴定后，将构建重组的载体和慢病毒包装质粒共同转染293T细胞，然后通过实时PCR靶点筛选出有效的干扰序列。经Western blot和实时PCR的鉴定成功构建了CRH 的RNAi慢病毒载体，293T细胞包装后产生了高滴度的病毒颗粒。本实验为研究PVN 内CRH神经元敏感化在应激反应中的作用及进一步研究CRH 基因功能打下了基础。
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