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谈补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠PTEN mRNA 的影响论文
缺血性脑疾病主要是由于脑血供障碍，脑细胞功能丧失而引起的一系列神经系统功能障碍性疾病。在脑中风事件中，有80% 由脑缺血造成中风后神经功能缺失及死亡; 在我国，心脑血管病发病率居世界第二，其患病率、死亡率、致残率居高难下，严重影响着人们的生活质量和生活水平。补阳还五汤是目前治疗脑卒中等血栓性疾病应用频率最高的方剂，广泛应用于防治缺血性脑血管病、冠心病、心肌梗死及其他血栓栓塞性疾病。补阳还五汤治疗缺血性脑疾病疗效确切，但其分子机制仍待进一步研究; 课题组前期研究发现补阳还五汤具有抗血小板的作用，同时，最新指南推荐在缺血性脑卒中的防治中应用抗血小板药物，而第10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因( PTEN)与P-选择素( CD62P) 与血小板活化密切相关。因此，本文使用补阳还五汤预处理2 周后的SD 大鼠复制局灶性脑缺血再灌注模型，测定血浆中血小板活化标记物CD62P 含量及海马组织中PTENmRNA 表达情况，探讨补阳还五汤对抗脑缺血再灌注损伤的分子机制与血小板活化的关系。
1 材料
1. 1 动物
SPF 级SD 雄性大鼠60 只，体重250 ～300 g，广东省医学实验动物中心提供，合格证号SCXK( 粤) 2013-0002。
1. 2 药物与制剂
硫酸氢氯吡格雷片( 赛诺菲制药有限公司，批号2A782) ，补阳还五汤颗粒剂水溶液按照《医林改错》所载的药味用量进行制备。处方为: 生黄芪120 g，当归尾6 g，赤芍4. 5 g，地龙、桃仁、红花、川芎各3 g，( 黄芪颗粒剂，批号311001T;当归颗粒剂，批号1307117; 赤芍颗粒剂，批号309081T; 地龙颗粒剂，批号1308206; 川芎颗粒剂，批号1308137; 桃仁颗粒剂，批号309127T; 红花颗粒剂，批号1307190) ，取相当于饮片等量的各味药颗粒剂( 由广东一方制药有限公司提供) 混合后，用100 ℃蒸馏水配制成补阳还五汤水溶液备用。
1. 3 仪器与试剂
ABI 7500 型荧光定量PCR 仪( 美国ABI 公司) ，Hema9600 型基因扩增仪( 珠海黑马医学仪器有限公司) ，1524R 型低温冷冻离心机( 珠海黑马医学仪器有限公司) ， JS-power300 型电泳仪与培清JS-780 型全自动凝胶成像分析仪( 上海培清科技有限公司) ，K2800 型紫外核酸分析仪( 北京凯奥科技有限公司) 。CD62P 试剂盒( 华美生物公司，批号CSB-E07399r) ，SYBR K Premix Ex TaqTM( 日本TAKARA 公司，批号DRR420A) ，ReverseTranscriptase M-MLV 试剂盒( 日本TAKARA 公司，批号D2639A) ，Trizol ( 美国Invitrogen 公司，批号10296-010) ，CTAB( 美国BBI，批号CB0108) ，DEPC( 美国Sigma 公司，批号472565 ) ，琼脂糖( Hydragene，批号R9012TAB) ，其余所需试剂由广州化学制剂总厂提供。
2 方法
2. 1 动物分组使用随机数字表法将60 只雄性SD 大鼠随机分成5 组，每组12 只。即假手术组( 生理盐水ig) 、模型组( 生理盐水ig) 、氢氯吡格雷组( 6. 8 mg·kg - 1·d - 1 ) ，补阳还五汤高、低剂量组( 26，6. 5 g·kg - 1·d - 1 ) ，以上各组所用剂量均参照课题组前期实验; 适应性饲养1 周后，再按照相应的药物ig 给药，每天2 次，连续2 周。
2. 2 局灶性脑缺血再灌注模型制作大鼠造模参照文献的方法，采用大鼠大脑中动脉线栓法( MCAO) 复制局灶性脑缺血模型，并在造模前2 h给予相应药物ig。大鼠10%水合氯醛( 1. 0 g·kg - 1 )ip 麻醉后，将大鼠固定于手术操作台上，消毒后其余步骤参照文献进行。假性手术组仅作皮肤切开和血管剥离，不做栓线处理，其余操作同其他组。造模完成后60 min 拔除栓线，待动物清醒后2 h 进行神经功能评分。
2. 3 观察指标
2. 3. 1 神经行为评分动物于清醒后2 h 参照文献进行神经行为评分。评分标准如下: 0 分无神经损伤症状; 1 分不能完全伸展对侧前爪; 2 分向对侧转圈; 3 分向对侧倾倒; 4 分不能自发行走，意识丧失。
2. 3. 2 检测血浆CD62P 含量拔除栓线再灌注12 h后大鼠经10%水合氯醛ip 麻醉( 1. 0 g·kg - 1 ) ，眼眶取血约2 mL 置于真空肝素钠抗凝管中，4℃，3 000 r·min - 1，离心30 min，吸取血浆，放置于- 20 ℃冰箱，备测。采用酶联免疫定量检测技术检测大鼠血浆CD62P 的含量; 操作过程均严格按照试剂说明书进行。
2. 3. 3 测定海马组织PTEN mRNA 表达拔除栓线再灌注12 h 后大鼠经10% 水合氯醛ip 麻醉( 1. 0g·kg - 1 ) ，生理盐水灌洗，4%多聚甲醛固定后迅速取脑组织，分离海马，用RNA later 溶液预处理海马组织。Trizol 法进行总RNA 提取海马组织总RNA，并进行纯度分析。引物设计与合成由广州贝奥吉因生物科技有限公司完成，PTEN 与内参基因引物序列详见表1。RNA 反转录与扩增严格按照试剂盒说明进行;反应结束后，确认Real-Time PCR 的扩增曲线和熔解曲线，由电脑自动分析并计算出反应体系中待测样本cDNA 达到设定阈值的循环数( cycle count，Ct) 。实验中各个样本均做2 个复孔。以假手术组做对照，使用2 - ΔΔCt值计算mRNA 相对表达情况。2. 4 统计学方法采用SPSS 19. 0 统计软件，结果均以珋x ± s 表示，等级资料比较采用Kruskal-Wallis检验，计量资料比较采用单因素方差分析检验和方差齐性检验，组间数据采用LSD-t 检验或者Nemenyi检验( 非参数检验两两比较) ，以P < 0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 对神经行为评分的影响与假手术组比较，模型组的神经行为评分显著升高; 与模型组比较，补阳还五汤与氢氯吡格雷均能明显降低大鼠神经行为评分( P < 0. 01)。
3. 2 对血浆CD62P 含量的影响与假手术组比较，模型组血浆中CD62P 表达显著升高( P < 0. 05) ; 与模型组比较，补阳还五汤高剂量组与氢氯吡格雷组均能显著抑制血浆中CD62P 表达( P < 0. 05)。
3. 3 对海马组织中PTEN mRNA 表达的影响与假手术组比较，模型组海马组织中PTEN mRNA 表达显著升高( P < 0. 05) ; 与模型组比较，补阳还五汤与氢氯吡格雷均能下调海马组织PTEN mRNA 的病理性过表达( P < 0. 05)。
4 讨论
脑血管疾病为临床常见病，由于其病死率高，国内外在临床治疗上仍主要推荐以阿司匹林预防为主，但10 年前有学者发现阿司匹林与氢氯匹格雷在脑缺血疾病防治中出现了无应答状况，因此，寻找类似抗血小板药物迫在眉睫。近年研究发现补阳还五汤具有抗血小板活化、神经保护、抗氧化、抗炎等作用，在临床抗脑缺血治疗中应用广泛; 尹天雷通过原位杂交实验发现补阳还五汤能上调磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B( PI3K/AKT) 阳性细胞表达，其抗脑缺血作用与调节PI3K/AKT信号转导表达有关。PTEN 基因是具有蛋白酯酶与磷酸酶双重生物活性的抑癌基因，能够使PI3K 产生的第二信使去磷酸化，进而调节PI3K/AKT 信号通路，干预细胞凋亡过程进而起到神经保护作用。本文研究亦发现在缺血预处理中，补阳还五汤神经保护作用与下调PTEN 基因有关。另外，Weng Z 等研究发现PTEN 基因缺失会导致血小板数目增多、出血时间缩短，患者易于栓塞，即PTEN 基因参与了血小板激活过程; 不仅如此，PTEN 基因还可通过调节PI3K/AKT 信号通路调节细胞炎症通路进而减轻脑组织炎症反应。
此外，CD62P 亦可通过与白细胞相互作用参与炎症反应等过程。因此，本文选用血小板活化标记物CD62P 检测血小板活化情况，并在神经功能评分基础上检测了PTEN mRNA 表达情况，探讨补阳还五汤对抗脑缺血再灌注损伤与血小板活化的内在关系，结果发现补阳还五汤预处理能抑制血小板活化并显著降低模型大鼠的神经功能评分，其作用效果与氯匹格雷相似，提示补阳还五汤预处理的神经保护作用可能与其抑制血小板活化有关; 另外还发现脑缺血后血小板大量激活，PTEN 基因过度表达，易于出现脑梗后再出血并发症，而补阳还五汤能通过下调过表达的PTEN 基因而干预PI3K/AKT 信号通路，进而在调节细胞凋亡与血小板活化的同时，减轻炎性反应造成的组织损伤，表明补阳还五汤神经保护机制可能与下调PTEN 基因过表达及抑制CD62P表达有关，而其主要机制可能通过调节PI3K/AKT信号通路，未来笔者将进一步研究补阳还五汤对PI3K/AKT 信号通路的其他靶点基因的影响。
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