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详谈EZH2对HSCT6细胞增殖活化的影响论文
肝纤维化是持续性肝脏损伤的共同病理改变过程,主要表现为细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)在肝脏中的大量沉积,其持续发展可形成肝硬化和肝细胞癌。肝纤维化的形成机制目前尚不清楚,研究表明肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)的增殖活化是肝纤维化形成的关键,抑制HSC的增殖活化成为防治肝纤维化的重点。有文献报道,Zeste基因增强子同源物2(enhancerofzestehomolog2,EZH2)在纤维化形成中起重要作用。肝纤维化形成过程中,MAPK/ERK和PI3K/AKT通路被激活并起重要作用。研究发现,EZH2能够激活MAPK/ERK 和PI3K/AKT通路,从而引起疾病。本研究拟应用EZH2的抑制剂DZNep和小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)抑制EZH2的表达,考察其对HSC增殖活化的调控作用,探究其调控机制,以期为肝纤维化的防治提供新的靶点。
1 材料
1.1 细胞株
大鼠肝星状细胞株HSC睺6购于南京凯基生物科技发展有限公司。
1.2 试剂与仪器
DZNep购于Selleckchem公司;TGFβ1购于Peprotech公司;噻唑蓝MTT购于Sig瞞a公司;DMSO购于Sigma公司;胰蛋白酶、DMEM培养基为Hyclone公司产品;胎牛血清购于杭州四季青公司;山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司;脂质体Lipofectami瞡eTM 2000、Opti睲EM购于Invitrogen公司;EZH2、p睧RK、ERK、p睞KT和AKT抗体购于CellSignaling公司;α睸MA抗体购于北京博奥森生物技术有限公司;β瞐ctin抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司;倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司,日本);酶标仪(bio瞭ekEL)。
2 方法
2.1 HSC睺6细胞的培养
应用含10% 胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5% CO2 及饱和湿度条件下进行细胞培养,待细胞长至70% ~80% 密度时进行细胞传代。
2.2 DZNep的应用
加入DZNep24h前,将细胞传代至6孔培养板,每孔2x105细胞。实验分正常组、应用TGFβ1刺激的模型组、TGFβ1刺激并加入DZNep的恢复组。正常组不做任何处理;模型组加入TGFβ1刺激终浓度为10μg· L-1,TGFβ1作用于细胞的时间为48h;恢复组加入TGFβ1刺激终浓度为10μg· L-1,并加入DZNep刺激终浓度为1μmol· L-1,DZNep作用于细胞的时间为24h。
2.3 siRNA的合成
根据siRNA设计原则,设计针对EZH2基因的siRNA序列,在GenBank表达序列标签(EST)数据库应用BLAST检索,并确认所设计siRNA序列的唯一性,靶向目的基因EZH2的序列设计的两条链,正义链:5′睪GGCAUCUUUAU睠AAAGAUTT3′;反义链:5′睞UCUUUGAUAAAGAUGCCCTT3′。同样方法构建阴性对照组的两条链,正义链:5′睻UCUCCGAACGUGUCACGUTT3′;反义链:5′睞CGUGACACGUUCGGAGAATT3′,与任何编码序列无同源性,由吉玛制药有限公司合成有效siRNA干粉制剂。细胞培养及siRNA转染HSC睺6细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养基,37℃、5% CO2 培养。转染24h前,传代至6孔培养板,每孔2x105细胞。实验分正常组、模型组、阴性对照组和EZH2瞫iRNA实验组。正常组不做任何处理;模型组加入TGFβ1;阴性对照组转染FAM标记的阴性对照siR睳A并加入TGFβ1;实验组转染EZH2瞫iRNA并加入TGFβ1。用Opti睲EM和脂质体作为转染试剂进行转染,使siRNA终浓度均为100pmol· L-1,置于37℃、5% CO2培养箱转染6h后,每组加入完全培养基含TGFβ1使刺激终浓度为10μg· L-1,继续培养48h,收获细胞。采用荧光倒置显微镜观察各组转染后的细胞形态并判断转染效果。
2.4 细胞增殖实验
以MTT法检测HSC睺6细胞的增殖,分组同上。将培养的HSC睺6细胞以10%胎牛血清的DMEM制备成1x108· L-1的细胞悬液,接种于96孔板,每孔100μL,过夜,待细胞贴壁后进行细胞转染,转染后6h换液,每孔加入完全培养基200μL含TGFβ1使刺激终浓度为10μg·L-1,37℃、5% CO2培养箱中继续培养12、24、48、72h,然后每孔加05% MTT贮存液20μL继续孵育4h,最后弃上清,每孔加入150μL二甲基亚砜溶解细胞内结晶,置于恒温震荡器上震摇10min,应用酶标仪于490nm波长处测定吸光度值,以空白对照组作为对照组,其细胞存活率为100%,其余各组按:存活率/% =[(各实验组吸光度值脖镜孜光度值)/(对照组吸光度值-本底吸光度值)]x100%。
2.5 Westernblot检测EZH2、p睧RK、p睞KT、α睸MA蛋白表达
细胞的培养、分组、处理同上。DZNep作用24h或者转染EZH2瞫iRNA48h后,分别提取细胞总蛋白,应用BCA法测定蛋白浓度。应用10% SDS睵AGE凝胶进行电泳,在200mA恒定电流下应用PVDF膜进行转膜,TBST洗膜后,使用5% 牛奶封闭非特异性结合位点,TBST洗膜后,在4℃于一抗(1∶500)中孵育过夜,TBST洗膜后,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或抗兔二抗(1∶10000)室温中孵育1h,TBST洗膜后,加入ECL发光剂反应20s,电脑显影成像,实验重复3次或以上。
2.6 统计学处理
采用SPSS130软件进行统计分析,数据以珋x±s表示。两组间比较采用t检验,多__组间比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 Westernblot法检测应用DZNep后HSC睺6细胞中EZH2、p睧RK、p睞KT和α睸MA蛋白表达变化 加入TGFβ1的模型组EZH2蛋白表达水平明显升高,与正常组相比差异有显著性(P<001),加入TGFβ1和DZNep的恢复组EZH2蛋白表达水平明显降低,与模型组相比差异有显著性(P<001),见Fig1A;同时,模型组p睧RK和p睞KT蛋白表达水平明显升高,与正常组相比差异有显著性(P<001),恢复组p睧RK和p睞KT蛋白表达水平明显降低,与模型组相比差异有显著性(P<001),见Fig1B;与此同时,模型组α睸MA蛋白表达水平明显升高,与正常组相比差异有显著性(P<001),恢复组α睸MA蛋白表达水平明显降低,与模型组相比差异有显著性(P<001),见Fig1C。
3.2 MTT法检测HSC睺6增殖活性 MTT实验结果显示,EZH2瞫iRNA瞬时转染对TGFβ1诱导的HSC睺6细胞的增殖有明显的抑制作用,EZH2瞫iR睳A实验组作用12h细胞抑制率与阴性对照组、模型组之间差异无显著性(P>005);EZH2瞫iRNA实验组作用24、48、72h细胞抑制率明显高于阴性对照组、模型组(P<005)。同时,作用24、48、72h时模型组、阴性对照组与正常组之间差异有显著性(P<005),见Fig2。
3.3 Westernblot法检测siRNA转染后HSC睺6细胞中EZH2、p睧RK、p睞KT和α睸MA蛋白表达变化 瞬时转染EZH2瞫iRNA48h后,EZH2蛋白表达明显降低,与阴性对照组相比差异有显著性(P<001),阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性(P<001),见Fig3A;同时,EZH2瞫iRNA实验组p睧RK和p睞KT蛋白表达也明显降低,与阴性对照组相比差异有显著性(P<001),阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性(P<001),见Fig3B;与此同时,EZH2瞫iRNA实验组α睸MA蛋白表达也明显降低,与阴性对照组相比差异有显著性(P<001),阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性(P<001),见Fig3C。
4 讨论
HSC的增殖活化是肝纤维化发生发展的关键环节,抑制HSC的增殖活化成为预防和治疗肝纤维化的重要手段之一。近些年研究发现,表观遗传学(包括DNA甲基化、microRNA和组蛋白修饰等)在肝纤维化的发生发展中扮演重要角色。组蛋白修饰是指在组蛋白相关酶的作用下,组蛋白发生乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等修饰的过程。组蛋白的甲基化修饰是由组蛋白甲基转移酶来实现的,组蛋白的甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上,最终可导致基因的转录沉默或转录激活。研究发现,组蛋白的甲基化修饰与HSC的状态及转归密切相关。EZH2是一个重要的组蛋白甲基转移酶,通过特异性甲基化基因启动子区域组蛋白H3赖氨酸27,广泛参与了基因的转录沉默。在癌症的发生发展中,EZH2被认为是一个促癌基因,在子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤中高表达。有研究发现,EZH2在肝纤维化形成中扮演重要角色,但是其具体机制尚不清楚。
有文献报道,在生长因子TGFβ1等的刺激下,MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路被激活,进而影响到大鼠肝星状细胞HSC睺6的增殖活化。有研究发现,EZH2能够激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路从而引起疾病的发生。那么EZH2能否影响TGFβ1诱导的HSC的增殖活化,EZH2通过何种机制影响其增殖活化,目前尚未见文献报道。在该项研究中,应用TGFβ1诱导HSC增殖活化,同时应用EZH2的抑制剂DZNep和siRNA技术,抑制HSC睺6中EZH2的表达,观察EZH2表达下调后对TGFβ1诱导的HSC增殖活化的影响,及其对MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的影响。应用EZH2的小干扰RNA后,与阴性对照组比较,EZH2瞫iRNA实验组EZH2蛋白表达水平明显降低,表明瞬时转染实验成功。MTT法是评估细胞增殖的一种有效方法,MTT的结果表明,通过siRNA沉默EZH2的表达可明显抑制TGFβ1诱导的HSC睺6细胞的增殖。α睸MA是HSC活化的特征性标志,Westernblot检测结果显示,应用抑制剂DZNep后,可明显降低α睸MA蛋白的表达;靶向干扰HSC睺6细胞中EZH2的表达,可明显降低α睸MA蛋白的表达。表明抑制EZH2的表达能影响TGFβ1诱导的HSC的增殖活化。结果进一步表明,应用TGFβ1刺激HSC睺6细胞可明显升高EZH2蛋白表达水平,也可明显升高p睧RK、p睞KT蛋白表达水平。应用抑制剂DZNep后可明显降低EZH2蛋白表达水平,也可明显降低p睧RK和p睞KT蛋白表达水平。靶向干扰HSC睺6细胞中EZH2基因的表达,可明显降低EZH2蛋白表达水平,也可降低p睧RK和p睞KT蛋白表达水平。表明抑制EZH2的表达能影响TGFβ1诱导的HSC中MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的激活。抑制EZH2的表达能影响MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的激活,是影响TGFβ1诱导的HSC增殖活化的机制。
综上,抑制HSC睺6细胞中EZH2基因的表达,能影响TGFβ1诱导的HSC 中MAPK/ERK 和PI3K/AKT信号通路的激活,从而抑制HSC的增殖活化。本研究从细胞分子水平阐明EZH2对HSC的增殖活化的调控作用及其可能的潜在调控机制。揭示了EZH2在肝纤维化发展中的重要作用,可能成为防治肝纤维化的潜在新靶点,还需要通过其它实验进一步验证。肝纤维化的形成过程非常复杂,EZH2如何调控基因的沉默,尚需进一步深入研究。
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