谈PTEN对苦参碱抑制LoVo细胞的影响论文

谈PTEN对苦参碱抑制LoVo细胞的影响论文

　　苦参碱是中药苦参中的主要生物碱类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗胆管瘢痕等多种生物活性。人第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologd on chromosome 10，PTEN)是Li等在1997年发现的一种新的抑癌基因。苦参碱可通过灭活Akt通路抑制人结肠癌LoVo 细胞系增殖和诱导凋亡。本研究采用小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)技术沉默PTEN 基因，探讨PTEN 在苦参碱抑制LoVo细胞增殖、迁移、侵袭及诱导凋亡中的作用，报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般材料

　　结肠癌细胞系LoVo由哈尔滨医科大学附属第四医院检验科实验室惠赠。苦参碱(98%)(成都普菲德生物技术有限公司)，DMEM 高糖培养基(Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭科技有限公司)，Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，siRNA(上海吉玛制药技术有限公司)，PTEN 抗体，Bax、Bcl-2抗体(北京中山金桥生物技术有限公司)，p-Akt抗体(江苏睿灜生物技术有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　LoVo细胞用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液(含青霉素100u/mL和链霉素100mg/L)，并置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养。

　　1.2.2 siRNA序列的合成及转染

　　在PTEN-siRNA3条序列中选取其中沉默效率最高的1条序列，序列为5’-CCAGUCAGAGGCGCUAUGUTT-3’;阴性对照组siRNA(NC-siRNA)序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。按吉玛转染说明书将PTENsiRNA与lipofectamine>TM2000混合形成转染复合物，将转染复合物与OPTI-MEM 培养液加入培养的细胞中，转染24h后更换为含血清的DMEM 培养液继续培养。

　　1.2.3 实验分组

　　将LoVo细胞分为空白对照组、转染组、转染加药组、阴性对照组、阴性转染加药组和加药组。其中转染组LoVo细胞转染PTEN-siRNA，转染加药组转染PTEN-siRNA 并加入苦参碱1mg/mL，阴性对照组转染NC-siRNA，阴性转染加药组转染NC-siRNA并加入苦参碱1mg/mL，加药组不转染但加入苦参碱1mg/mL，空白对照组不转染不加药。

　　1.2.4 MTT法检测细胞增殖能力

　　空白对照组和转染组细胞分别采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、2.50mg/mL苦参碱处理，培养24、48、72h后分别加入MTT溶液20μL，继续培养4h后弃上清，加入150 μL 二甲基亚砜振荡溶解，酶标仪(SpectraMax M5)490nm波长下读取吸光度(opticaldensity，OD)值。

　　1.2.5 细胞迁移能力检测

　　将各组细胞分别以每孔2×105 密度接种于6孔板中，待细胞长满时用200μL枪头在每孔中垂直划一道直线，吸取培养液，PBS清洗2次，更换新鲜不含血清的培养基，并分别用苦参碱(0、1.0mg/mL)处理，分别于0、24、48h后拍照，比较各组细胞迁移距离。

　　1.2.6 细胞侵袭能力检测

　　将Matrigel基质胶用DMEM 完全培养基1∶8稀释后均匀铺在孔径为8μmol/L的Transwell小室上表面，置于37℃培养箱中4h使之凝固。将已处理的各组细胞用胰酶消化后，分别用不含血清的培养基重悬，以2×105 个/孔密度接种于小室上室，下室加入含体积分数10%胎牛血清的培养液，继续培养24h后用棉签擦掉小室上表面未穿越的细胞，甲醇固定，质量分数0.1%结晶紫染色，随机取5个视野200倍光镜下拍照。

　　1.2.7 Western blot检测

　　分别将培养48h的各组细胞收集起来，采用RIPA 裂解液提取蛋白，BCA 法进行蛋白定量。蛋白上样SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白后，将蛋白转移到PVDF 膜上，置于PBST配置的质量分数5%脱脂牛奶中室温封闭1h，加入一抗，于4℃孵育过夜，PBST洗涤后加入二抗(山羊抗兔IgG)，室温孵育1h，PBST洗涤后用化学发光试剂处理后显影。

　　1.3 统计学处理

　　采用Graphpad Prism 6.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(珚x±s)表示，采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 空白对照组和转染组细胞残余活性比较

　　培养48h后，转染组不同苦参碱浓度作用下细胞残余活性均高于空白对照组(P<0.05)。随苦参碱浓度升高，2组细胞残余活性均降低。 空白对照组和转染组细胞残余活性比较 (珚x±s，%)。

　　2.2 各组细胞迁移距离比较

　　处理24、48h时，空白对照组细胞刮痕宽度长于转染组、转染加药组，短于阴性加药组和加药组(P<0.05)。转染加药组、阴性转染对照组、阴性转染加药组和加药组细胞刮痕宽度长于转染组(P<0.05)，阴性对照组、阴性转染加药组和加药组长于转染加药组，阴性转染加药组和加药组长于阴性对照组(P<0.05)。阴性转染加药组细胞迁移距离与加药组比较差异无统计学意义(p>0.05)。

　　2.3 各组细胞穿膜数量比较

　　与空白对照组相比，转染组及转染加药组细胞穿膜数量均增加，阴性转染加药组和加药组细胞穿膜数量均减少。

　　2.4 各组细胞PTEN、p-Akt、bax、bcl-2蛋白表达水平比较

　　空白对照组PTEN、Akt、bax蛋白表达量低于加药组和阴性转染加药组，高于转染组和转染加药组(P<0.05)。转染组PTEN、bax蛋白表达量明显低于空白对照组、加药组和阴性转染加药组，高于转染加药组(P<0.05)，与阴性对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。转染组bc达明显高于空白对照组、阴性对照组、加药组和阴性转染加药组，低于转染加药组(P<0.05)。空白对照组pten、akt、bax、bcl-2蛋白表达量与阴性对照组比较差异均无统计学意义(p>0.05)。空白对照组p-Akt蛋白表达明显低于转染组和转染加药组(P<0.05)，高于阴性转染加药组和加药组(P<0.05)，与阴性对照组比较无统计学差异(p>0.05)。

　　3 讨 论

　　目前关于苦参碱抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡相关机制的研究较多，研究结果表明苦参碱通过抑制JAK2/STAT3 信号通路诱导胆管癌KMCH-1和MzChA-1细胞凋亡。苦参碱可通过引发线粒体途径抑制视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞生长及诱导凋亡。但关于PTEN在苦参碱抑制肿瘤细胞生长促进凋亡中的作用的研究较少。本研究应用siRNA技术对结肠癌LoVo细胞PTEN 基因进行研究，比较沉默PTEN前后及联合苦参碱处理后LoVo细胞的生长情况，结果表明在沉默PTEN 基因后，苦参碱抑制LoVo细胞的增殖作用明显减弱，迁移和侵袭能力明显增强，未经PTEN-siRNA转染单纯使用苦参碱处理的LoVo 细胞迁移和侵袭能力均减弱。

　　Western blot结果显示加药组PTEN表达明显高于空白对照组，转染加药组PTEN 水平高于转染组，提示苦参碱可上调PTEN 表达水平，当沉默PTEN 时，p-Akt表达水平明显上调，说明PI3K-Akt信号通路被激活并抑制细胞凋亡。PTEN作为PI3K-Akt信号通路的负向调节因子，可抑制PI3K-Akt信号通路激活并促进肿瘤细胞凋亡。当PTEN 基因被沉默、突变、灭活时可激活PI3K 的效应器，尤其是激活Akt，进而引起肿瘤发生。研究结果表明，人类恶性肿瘤中Akt活性明显增强，Akt的活化对肿瘤的发生、发展起重要作用。

　　Bcl-2是重要抗凋亡基因，bax是重要促凋亡基因，Bcl-2可与促凋亡基因Bax形成二聚体，如Bax相对量高于Bcl-2，则Bax同二聚体的数量增多，从而促进细胞死亡;如Bcl-2相对量高于Bax，则促进形成Bcl-2/Bax异二聚体，并使Bcl-2同二聚体的量增多，从而抑制细胞死亡。本研究结果显示，加药组中bax表达高于空白对照组，bcl-2表达低于空白对照组，提示苦参碱可诱导bcl-2表达水平下调、诱导bax表达水平上调，PTEN基因沉默时，苦参碱对2种蛋白的表达水平呈相反作用，抑癌基因PTEN在苦参碱抑制LoVo细胞增殖、迁移、侵袭及诱导凋亡中起关键作用，苦参碱抑制LoVo细胞增殖、迁移、侵袭及诱导凋亡的机制是通过PTEN-Akt信号通路。本研究结果提示，PTEN可能成为结肠癌治疗的新靶点，为苦参碱研发成抗肿瘤新药提供了实验依据。

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