用SNP array 对一例额外小标记染色体携带者的细胞遗传影响分析论
额外小标记染色体(small supernumerary marker chromosome，sSMC)是人类染色体中，除正常染色体外，额外的1 条结构异常、来源不明的多余染色体，其大小在中期分裂相中一般小于或等于20 号染色体。据统计，在全世界范围内约有250 万人携带有sSMC。sSMC 的表型效应取决于来源、片段大小和常染色质所占的比重。此外，sSMC 形态结构异常且多样，传统的核型分析技术很难明确其构成，因此需要更精确的分子遗传学技术来对其进行分析。本研究利用SNP array 对1 例核型分析技术无法明确鉴别的sSMC 进行检测并分析其表型效应，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
男，28 岁，结婚4 年，配偶孕3 产0，均在怀孕2-3 个月时不明原因流产，非近亲结婚，孕期无接触有害物质，夫妻双方智力正常，否认家族遗传病史。为查明流产原因夫妻二人前来安徽省妇幼保健院遗传中心检查染色体，G 显带核型分析显示男方为47,XY,+mar，其父母以及配偶核型正常。
1.2 基因组DNA 提取
抽取患者静脉血2ml 于EDTA抗凝管中，1000r/min 离心10min，留取细胞沉淀，按照QIAamp DNA blood Mini Ki(t 德国Qiagen公司)说明书操作，提取样本基因组DNA。用洗脱液洗脱DNA，Nanodrop2000 分光光度计(美国Thermo 公司)测定DNA 浓度，保持DNA 样本吸光度(A260/280nm)为1.7 ～ 1.9，DNA 样本置-80℃。
1.3 SNP array 检测 取200ng DNA 样本(4μl)， 按照Humancyto SNP-12 BeadChip kits 芯片(Illumina 公司)说明书操作进行SNP array 检测，采用iscan 扫描系统进行数据采集，用GenomeStudio 软件分析结果。
2 结果
我们将拷贝数变异(copy number variants，CNVs)检测阈值设为500×103 bp 和20 个探针检测位点，可信度大于80。结果发现样本Smoothed LogR 值在4q12-q13.2 区域显著增加(探针位置52728324-6955649，大小为16.4Mb)，显示此区段发生了重复。表明患者sSMC 由4q12-q13.2 构成，核型可表示为47,XY,+dup(4q12-q13.2)。
3 讨论
sSMC 大小在中期分裂相中一般小于或等于20 号染色体，且形态异常，因此G 显带核型分析技术仅能够识别其存在，但不能够明确其来源。而其它的显带技术，如C 显带和N 显带，也只能够用于对sSMC 来源的大致判断，如是否带有随体、着丝粒等。因此对sSMC 的明确鉴别必须依靠其它的分子细胞遗传学技术，目前最为直接的方法是显微切割技术，但该方法操作繁琐且工作量大，在临床上难以推广。之后相继出现的荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)，多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)等快速检测染色体的方法存在探针选择上的局限，也使得它们在sSMC 的`鉴别中作用有限。SNP array 是近年来建立的一种新型染色体分析技术，能够通过对基因组CNVs 进行检测来快速、精准地得到染色体的不平衡畸变信息。最初SNP array 主要被用于肿瘤以及遗传病的基础研究，但最近利用SNP array 在临床上用于诊断染色体畸变的报道越来越多。如Li 等应用SNP array 对81 例流产组织进行染色体检测，其异常检出率较传统核型分析技术明显要高。Malgorzata 等利用SNP array 对61 例B 超显示胎儿异常的孕妇进行产前诊断。本研究中，我们尝试将SNP array 对1 例sSMC 携带者进行检测，发现其sSMC 由4q12-q13.2 构成，片段大小为16.4Mb。表明SNP array 也能够很好的应用于鉴别sSMC 来源。
sSMC 由于额外常染色质的组成差异、染色质的嵌合程度及亲本染色体的同源性等因素，由sSMC 引起的临床表型有相当大的个体差异，可以表现正常，也可以表现出严重多器官畸形和智力低下等染色体病临床特征。通常来说，智力低下与sSMC 是否新发密切相关，新突变个体智力低下的可能性较大，而家族遗传的sSMC 携带者智力低下的可能性较小。本研究中，患者被发现携带sSMC，而对其父母双方进行染色体核型分析后没有异常发现，因此，我们可以判断患者的sSMC 不是家族遗传的，而是新突变的。基于本病例 sSMC 中常染色质的组成和含量及其新突变的特点，本病例应该存在4q12-q13.2 重复的临床表型。目前为止，全世界报道的4q12-q13.2 重复病例仅为2 例。Mattei 等最先报道了1 例存在4q12-q13 重复的6 岁女孩，其临床表型包括智力低下、生长发育迟缓、小头畸形以及内眦赘皮。之后Shashi 等报道了1 例表型类似病例，并且认为4q12-q13.2 重复导致的表型较轻微。在本研究中，患者无上述异常，我们推测可能是4q12-q13 重复导致的表型较轻微，在某些个体甚至无临床表现，这也能够解释为什么至今为止4q12-q13 重复的病例仅有2 例被报道过。但根据Buckton 等的研究，sSMC 与生育力低下密切相关。本研究中，患者夫妻三次妊娠失败且其它各项生殖检测均正常，强烈提示患者的妊娠失败与sSMC 有关。但sSMC导致生育力低下的原因，目前尚不得而知。
综上所述，SNP array 能够检测传统核型分析无法检测到的sSMC，其结果为全面和准确地描述sSMC 以及为核型-表型相互关系的研究提供了一种强大的分析法。目前SNParray 已应用于不孕夫妇染色体检测、植入前遗传学诊断、产前诊断等辅助生殖领域，为疾病的诊断带来了新的思路，解决了很多之前检测方法无法解决的问题，相信在不久的将来一定会得到更广泛应用。
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